Entinostat (MS-275)强烈抑制HDAC1和HDAC3，无细胞试验中IC50分别为0.51 μM和1.7 μM，抑制作用强于HDACs 4， 6， 8，和10。

靶点

体外研究

MS-275通过作用于2′-氨基而抑制HDACs。MS-275作用于 K562细胞，诱导 p21WAF1/CIP1和凝溶胶蛋白的累积。MS-275作用于A2780细胞，可以降低S期细胞，提高G1期细胞。 MS-275通过抑制HAD而抑制人类肿瘤细胞系，包括 A2780, Calu-3, HL-60, K562, St-4, HT-29, KB-3-1, Capan-1, 4-1St和 HCT-15细胞增殖， IC50 为41.5 nM到4.71 μM。MS-275抑制HDACs，作用于HDAC1和 HDAC3时IC50 分别为0.51 μM和1.7 μM。而对其他的HDACs没有抑制效果，如HDAC4, 6, 8和10。MS-275有效抑制人类白血病和淋巴癌细胞，包括U937, HL-60, K562, 和Jurkat。MS-275可以诱导U937细胞p21CIP1/WAF1 调节的生长和变异Marker (CD11b)的表达。MS-275降低cyclin D1和抗凋亡蛋白Mcl-1与XIAP的表达。

体内研究

MS-275按49 mg/kg剂量作用于除了HCT-15的人类移植瘤都显示出强抗癌活性。MS-275促进恶性实体瘤和恶性血液病的治疗可能性，及生理和畸变基因表达的调节。MS-275和IL-2联用，作用于肾细胞癌显示出强抗癌活性，因为降低调节性T细胞和增强脾细胞的表达。

Givinostat (ITF2357)

MB3740

JNJ-26481585

MB3550

LMK235

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.6567 mL

13.2834 mL

26.5668 mL

5 mM

0.5313 mL

2.6567 mL

5.3134 mL

10 mM

0.2657 mL

1.3283 mL

2.6567 mL

50 mM

0.0531 mL

0.2657 mL

0.5313 mL

标准HDAC实验:
用HDAC buffer按1:6稀释鼠肝内的酶。重组人类HDACs按1:4稀释在HDAC buffer中。用于标准HDAC实验，60 μl HDAC buffer和10 μl 稀释的酶溶液在30oC混合。在HDAC buffer中加入30 μl基底液开始HDAC反应，随后在30oC下温育30分钟。加入100 μl胰蛋白酶溶液终止反应，胰蛋白酶溶液由溶于50 mM Tris-HCl（pH 为8.0）的10 mg/ml 胰蛋白酶, 100 mM NaCl,及 2 μM TSA组成。30oC下温育20分钟， 通过测定460纳米(λex = 390 nm)处的荧光监测AMC的释放。使用释放的AMC校准荧光强度 。用于标准时间过程实验，在初始100 μl HDAC 反应中加入20 pmol 基底物。2-50 pmol 基底物的酶法分析产物获得荧光AMC，通过测量这种荧光AMC来测定 Km值和 Vmax值。使用Hanes 图分析实验数据。记录的AMC信号是针对没有酶而有buffer和基底物的空白区。

细胞实验

• Cell lines: A2780, Calu-3, HL-60, K562, St-4, HT-29, KB-3-1, Capan-1, 4-1St和HCT-15细胞
• Concentrations: 10 μM 左右
• Incubation Time: 3天
• Method: 5×103个肿瘤细胞接种到96孔板上，加入梯度浓度MS-275培养三天。细胞用0.1 mg/mL中性红在CO2反应器中染色1小时，测定中性红与50 μL乙醇和150 μL 0.1 M Na2HPO4溶解后的OD540,测定IC50值。

动物实验

• Animal Models: 侧腹皮下注射A2780, HT-29, HTC-15, KB-3-1, 4-1St, St-4, Capan-1和Calu-3细胞的裸鼠
• Formulation: 溶于0.05 N HCl, 0.1% Tween-80
• Dosages: 12.3, 24.5和49 mg/kg
• Administration: 每天口服处理一次，每周进行5天，持续4周。

Enzastaurin (LY317615)是有效的PKCβ选择性抑制剂，IC50为6 nM, 比作用于PKCα, PKCγ 和 PKCε选择性高6到20倍。

靶点

PKCβ

PKCα

PKCγ

PKCε

IC50

6 nM

39 nM

83 nM

110 nM

体外研究

Enzastaurin阻断U87MG恶性胶质瘤细胞，PC-3前列腺癌细胞 ，及HCT116结肠癌细胞的增殖。当Enzastaurin浓度低于1 μM时则可能对HCT116和U87MG细胞有温和的诱导。Enzastaurin阻断许多细胞系如K-562, MOLT-4, HOP-92, 和PC-3细胞系的增殖。当Enzastaurin浓度为4μM时可诱导HCT116结肠癌细胞和U87MG恶性胶质瘤细胞凋亡。Enzastaurin诱导HCT116结肠癌细胞凋亡存在剂量依赖性，用4 μM Enzastaurin处理HCT116细胞使TUNEL阳性细胞从基础水平2%涨到50%以上。活体研究显示，Enzastaurin明显阻断HCT116结肠癌细胞和U87MG恶性胶质瘤细胞的生长。Enzastaurin皮肤T细胞淋巴瘤的恶性淋巴细胞凋亡。Enzastaurin和GSK3抑制剂联用,提高细胞毒性水平。 Enzastaurin和GSK3抑制剂AR-A014418联用提高β-catenin 蛋白水平和β-catenin调节的转录水平。Enzastaurin 和AR-A014418联用阻断β-catenin调节的转录。此外，Enzastaurin 和AR-A014418联用提高 mRNA水平，及CD44表达。

体内研究

与单独使用相比，Enzastaurin结合辐射对异种移植瘤的治疗使微血管的密度产生更大的降低。微血管密度的降低与肿瘤生长延缓相一致。

Go 6983

MB4599

Sotrastaurin

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9395 mL

9.6973 mL

19.3945 mL

5 mM

0.3879 mL

1.9395 mL

3.8789 mL

10 mM

0.1939 mL

0.9697 mL

1.9395 mL

50 mM

0.0388 mL

0.1939 mL

0.3879 mL

激酶实验:
使用滤板法测定髓鞘碱性蛋白基底33P的渗透率，而测定用Enzastaurin阻断PKCβII, PKCα, PKCε,或PKCγ的活性。在96孔板上加100μl反应物进行反应，反应物包括90 mM HEPES (pH 为7.5), 0.001% Triton X-100, 4% DMSO, 5 mM MgCl2, 100 μM CaCl2, 0.1 mg/ml磷脂酰丝氨酸, 5 μg/ml 二乙酰甘油, 30 μM ATP, 0.005 μCi/μl 33ATP, 0.25 mg/ml髓鞘碱性蛋白, enzastaurin的连续稀释物 (浓度为1-2,000 nM),及重组人类PKCβII, PKCα, PKCε, 或 PKCγ酶(分别为390, 169, 719, 或128 pM)。加入酶反应开始，在室温下温育60分钟，加入10% H3PO4结束反应，转移到多屏阴离子磷酸纤维素96孔滤板上，温育30到90分钟，过滤，在真空歧管用4体积的0.5% H3PO4冲洗。加入闪烁混合物，板在Microbeta闪烁计数器上读数。

细胞实验

• Cell lines: HCT116和U87MG细胞系
• Concentrations: 0.3-4 μM
• Incubation Time: 72小时
• Method:

通过核小体分裂和末端转脱氧核苷酰酶调节的缺口末端标记(TUNEL)法标记HCT116和U87MG细胞系，用于测定Enzastaurin的凋亡诱导率。在96孔板上每孔加5×103个细胞（添加FBS的条件培养基），在有（实验组）或没有（对照组）Enzastaurin的环境下温育48到72小时。Enzastaurin的浓度从0.1到10 μM不等。加入原位细胞凋亡检测，荧光试剂进行原位TUNEL染色。在6孔板上，每孔加75×103个HCT116和U87MG细胞，在1% 添加FBS的培养基 ± Enzastaurin环境下温育72小时用Epics流式细胞仪测定荧光标记的DNA链断裂。收集10x103FITC染色的单细胞用于各项试验。

动物实验

• Animal Models: 无胸腺裸鼠
• Formulation: 溶于水的10% 胶
• Dosages: 75 mg/kg，每天两次
• Administration: 饲喂处理

TESTS

SPECIFICATIONS

RESULTS

Appearance

Orange powder

Conforms

Identification

HNMR

Conforms

Purity(HPLC)

≥98%

99.53%

Conclusion

Passed