NCI-H747人盲肠癌细胞

1、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm²培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜*培养液继续培养或进行传代。

2、细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm²培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入*培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml*培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，*后放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养；

4）待细胞*贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm²培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入*培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9 ：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。 

4、细胞复苏：
1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2）将冻存管中的细胞移至含5ml*培养基的15ml离心管中， 1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀用5ml*培养基重悬，接种25cm²培养瓶，于37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜*培养基继续培养。

细胞处理方法：

一、贴壁细胞

1、 接收到细胞，肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞 100X,200X 各一张）。

2、用 75%的酒精消毒外包装,在超净工作台内打开外包装。

3、严格遵循无菌操作规范，打开细胞培养瓶。

4、37度平衡1-2小时。

5、用移液管吸取培养基，到50ml离心管中，剩下细胞密度达到80%至90%可以传代，如没有达到添加6ml新鲜培养基继续培养。

6、如果肉眼检查上清有细胞，对50ml上清进行离心收集细胞，如果细胞连片状态，弃掉上清对收集的细胞进行胰酶消化（1ml胰酶37度），接种培养。

二、悬浮细胞

1、接收到细胞，肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞 100X,200X 各一张）。

2、用 75%的酒精消毒外包装,在超净工作台内打开外包装。

3、严格遵循无菌操作规范，打开细胞培养瓶。

4、细胞培养瓶内的培养基用吸管*吸出（严禁直接倾倒）。

5、1000rpm，5min 离心，用吸管小心吸出上清，加入培养基，重悬细胞。

6、将重悬好的细胞转入六孔板或者细胞培养瓶种，加入新鲜培养基，置于 37℃，5%CO2 培养（大部分细胞）。

培养操作：细胞培养操作指南

细胞常见问题分析：细胞培养常见问题分析

细胞在发货前进行质检：

1、细胞存种的活性检测

2、细菌、真菌、霉菌污染物镜检

3、衣原体、支原体检测（荧光法、培养法等）

产品质量保证及售后：

1、 细胞为三代以内，活体。运输过程中细胞出现污染和状态不好，我们*免费重新发货。

2、 实验过程中若确定是客户问题，客户仅需支付物流和耗材费用，我们可重新发货。其他根据情况灵活处理。

3、 产品使用过程中，可提供技术上的指导。

NCI-H747人盲肠癌细胞

一，烧瓶培养的处理程序

在培养瓶中接种细胞并在培养基中*填充培养基以防止运输过程中细胞的丢失。

1、收到后，目视检查培养物是否有微生物污染的宏观证据。

使用倒置显微镜（配备有相位传感器），仔细检查是否有微生物污染的证据。还检查以确定大多数细胞是否仍然附着在烧瓶底部？在运输过程中，培养物有时被粗略地处理，并且许多细胞经常分离并悬浮在培养基中（但仍然是可行的）。

2、如果细胞仍然附着，无菌去除5至10毫升的运输介质。可以节省运输媒介以重复使用。在5%℃的空气中，在37℃下培养细胞，直到它们准备进行传代培养BGC-823人胃腺癌细胞（低分化）没有附着，无菌地移除烧瓶的全部内容物，并以1000rpm离心5至10分钟。取出运输介质并保存。在10毫升这种培养基中重新沉淀颗粒细胞并加入25厘米的烧瓶中。在空气中5%℃下，在37℃下孵育，直至细胞准备进行传代培养。

二、传代程序

体积为75厘米的烧瓶。增加或减少其他尺寸培养容器所需的分离培养基的量。

1、去除和丢弃培养基。

2.用0.25%(w/v)胰蛋白酶0.53mM EDTA溶液冲洗细胞层，除去所有含有胰蛋白酶抑制剂的血清痕迹。

3.添加2.0~3.0 ml胰酶-EDTA溶液瓶中，倒置显微镜下观察细胞到细胞层分散（取决于胰蛋白酶的批）。

注意：为了避免结块，不要在击打或摇晃瓶子时搅拌细胞，等待细胞分离。难以分离的细胞可以放置在37°C以促进扩散。

4、加入6～8毫升的完整生长培养基，轻轻吸液，抽吸细胞。

5、在新培养容器中加入适当的细胞悬液等分试样。

6、培养37°C培养基。

推荐栽培比为1:3∶1:4。

介质更新：每周2至3次

三、冷冻保存程序

该协议使用量在75平方厘米的瓶；比例减少或增加的其他尺寸的分离介质的培养容器的数量。

1、去除和丢弃培养基。

2。简要冲洗细胞层0.25（w/v）trypsin0.53mm EDTA溶液去除所有痕迹血清含有胰蛋白酶抑制剂。

3。加入2至3毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液瓶中，倒置显微镜下观察细胞到细胞层是分散的（通常在1到10分钟）。

注意：为了避免结块，不要在击打或摇晃瓶子时搅拌细胞，等待细胞分离。难以分离的细胞可以放置在37°C以促进扩散。

4、加入6～8毫升的完整生长培养基，轻轻吸液，抽吸细胞。

5。去除胰酶EDTA溶液，将细胞悬液到离心管和旋转约5 1000rpmfor 10分钟。

6、低温保存培养液中的上清液和复苏细胞。

7、将细胞转移至低温瓶，1ml／瓶。

8、低温容器中的细胞Frozen（NalgENα5100-01）。