JHH-4肝癌细胞

关于培养瓶内加入培养基的量的问题。
这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。
关于选择培养瓶的问题。
个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。
所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。

JHH-4肝癌细胞

消化/传代。

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞(以去除胰蛋白酶的抑制物)。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶)，消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

细胞传代培养的胰酶消化法：

传代培养：是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。

实验步骤：① 入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;

② 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液37℃下预热。

③ 超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;

④ 打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气除去臭氧;

⑤ 点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

⑥ 将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

⑦ 倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

⑧ 每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

⑨ 加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

⑩ 对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。