639-V细胞，移行细胞癌

细胞的冻存与复苏

为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于*停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存:为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下:

包含10%甘油的*培养基，

包含10%二甲基亚砜(DMSO)的*培养基，

50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或

50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。

对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是:

50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或

包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

639-V细胞，移行细胞癌

1、悬浮细胞

计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200~400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

以1×10⁷到5×10⁷细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在无血清培养基中，再次悬浮细胞。

分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2、贴壁细胞

使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。

在*生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

以5×10⁶到1×10⁶细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。

分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。

细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入*生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感，离心去除冻存培养基，然后加入*生长培养基中。

1、直接铺板方法

取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml*生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×10⁵活细胞/ml。培养细胞12到24小时，更换新鲜的*生长培养基，去除冻存剂。

2、离心方法

取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml*生长培养基，轻轻混匀。

以大约80x g离心2到3分钟。

弃去上清。

在*生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。

细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

三、细胞的分化、衰老与死亡

1、细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞:形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着。

由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。

2、细胞的衰老:体外细胞培养实验证明:

成纤维细胞:来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14–28次后衰老死亡,来自乌龟传代90–125次后衰老死亡。

细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括:蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现;同时，细胞核，线粒体，膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。

细胞衰老原因，尚无定论，出现过好几种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。

3、细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象，常见的细胞死亡形式有3种:坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中，因为环境因素的突然变化或病原物的入侵，导致一部分细胞死亡，称为细胞的病理死亡，或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡;细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于其它两种细胞死亡机理，如杀伤T细胞的细胞毒性作用。