Sorafenib是Raf-1, B-Raf和VEGFR-2的多重激酶抑制剂，无细胞试验中IC50分别为6 nM, 22 nM和90 nM。

靶点

体外研究

Sorafenib抑制野生型和V599E突变型B-Raf活性，IC50分别为22 nM 和 38 nM。Sorafenib也能有效抑制mVEGFR2 (Flk-1)，mVEGFR3，mPDGFRβ，Flt3，和c-Kit，IC50分别为15 nM，20 nM，57 nM，58 nM，和68 nM。Sorafenib 能够较弱地抑制FGFR-1，IC50 为580 nM。Sorafenib对ERK-1，MEK-1，EGFR，HER-2，IGFR-1，c-Met，PKB，PKA，cdk1/cyclinB，PKCα，PKCγ，和pim-1没有活性。Sorafenib显著抑制NIH 3T3细胞中VEGFR2磷酸化，IC50 为 30 nM，也会抑制HEK-293细胞中Flt-3磷酸化，IC50 为20 nM。Sorafenib有效阻断大多数细胞中MEK 1/2 和 ERK 1/2磷酸化，但不阻断A549 或 H460细胞中该过程，同时不影响PKB通路的抑制。Sorafenib抑制HAoSMC 和 MDA-MB-231细胞的增殖，IC50分别为0.28 μM 和 2.6 μM。除了抑制RAF/MEK/ERK信号通路，Sorafenib tosylate显著抑制eIF4E的磷酸化作用，并以MEK/ERK依赖的方式下调肝癌(HCC)细胞中Mcl-1水平。Sorafenib 抑制PLC/PRF/5 和HepG2细胞的增殖，IC50分别为6.3 μM 和 4.5 μM，并诱导显著的细胞凋亡。

体内研究

Sorafenib(~60 mg/kg)口服给药，对各种人肿瘤异种移植模型，包括MDA-MB-231，Colo-205，HT-29，DLD-1，NCI-H460，和A549表现出广谱的、剂量依赖性抗肿瘤活性，而没有毒性。与抗肿瘤功效相联系，Sorafenib 治疗有效抑制HT-29 和 MDA-MB-231异种移植物中MEK 1/2磷酸化和pERK 1/2水平，但对Colo-205异种移植物没有作用，并且也能显著抑制MDA MB-231，HT-29 和 Colo-205肿瘤异种移植物中肿瘤微血管面积(MVA)和微血管密度(MVD)。在SCID小鼠体内，Sorafenib治疗对PLC/PRF/5肿瘤异种移植产生剂量依赖性生长抑制，10 mg/kg和30 mg/kg剂量下，TGIs分别为49%和78%，与ERK 和 eIF4E磷酸化抑制，微血管面积减少，和肿瘤细胞凋亡的诱导相一致。Sorafenib通过下调NF-κB介导的Mcl-1 和 cIAP2表达的作用机制使bax-/-细胞对TRAIL剂量依赖性敏感。 Sorafenib (30-60 mg/kg) 与 TRAIL (5 mg/kg)结合对TRAIL抗性HCT116 bax-/-和HT29肿瘤异种移植物表现出显著的功效。

MB1226

Sorafenib tosylate

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

2.1514 mL

10.7569 mL

21.5137 mL

5 mM

0.4303 mL

2.1514 mL

4.3027 mL

10 mM

0.2151 mL

1.0757 mL

2.1514 mL

50 mM

0.0430 mL

0.2151 mL

0.4303 mL

生化检测:
重组杆状病毒表达的Raf-1 (残基305–648)和 B-Raf (残基 409–765)以融合蛋白纯化。全长人MEK-1由PCR产生，并以大肠杆菌裂解物中的融合蛋白纯化。将Sorafenib加入到含Raf-1 (80纳克)，或B-Raf (80 纳克) 以及MEK-1 (1 微克) 混合物的实验缓冲液[20 mM Tris (pH 8.2)，100 mM NaCl，5 mM MgCl2，和0.15% β-巯基乙醇]中，DMSO终浓度为1%。加入25微升10 μM γ[33P]ATP (400 Ci/mol)启动Raf激酶试验(终体积50微升)，并在32 °C下培育25分钟。磷酸化的MEK-1通过过滤到磷酸纤维素板上采集，使用1%磷酸洗掉未结合的放射性。微波炉加热干燥后，使用β型板计数器量化过滤器结合放射性。人VEGFR2 (KDR)激酶域被表达，并从Sf9裂解物中纯化。VEGFR2的时间分辨荧光分析法能量转移测试在96孔不透明板中以时间分辨荧光分析法能量转移格式进行。最终反应条件如下：1 到10 μM ATP，25 nM poly GT生物素，2 nM 铕标记的磷酸(p)-酪氨酸抗体(PY20)，10 nM APC，1% DMSO 终浓度的1 到 7 nM 细胞质激酶域，50 mM HEPES (pH 7.5)，10 mM MgCl2，0.1 mM EDTA，0.015% Brij-35，0.1 毫克/毫升BSA，和0.1% β-巯基乙醇。反应体积为100微升，加入酶启动反应。反应启动~1.5 到 2.0小时后，板以615 和 665 nM在Perkin-Elmer VictorV多标记分析仪上读数。信号按如下比率计算：对每孔(665 nm/615 nM) × 10,000。对IC50的产生，在酶起始反应之前加入Sorafenib。50倍的库存板由Sorafenib在50% DMSO/50%蒸馏水溶液中连续稀释制得。最终Sorafenib在1% DMSO中的浓度范围为10 μM 到 4.56 nM。

细胞实验

• Cell lines: MDA-MB-231，和 HAoSMC
• Concentrations: 溶解于DMSO，终浓度为~10 μM
• Incubation Time: 72小时
• Method: 细胞在逐渐增加浓度的Sorafenib下暴露72小时。细胞数通过Cell TiterGlo ATP发光测定试剂盒进行定量。该试验通过测定基于细胞中ATP量的发光信号，测量每孔中的活细胞。

动物实验

• Animal Models: 雌性 NCr-nu/nu 小鼠，皮下植入MDA-MB-231，Colo-205，HT-29，H460，或 A549 细胞
• Formulation: 以4倍(4 ×储备溶液，稀释为1 ×)溶解于聚氧乙烯蓖麻油/乙醇(50:50)
• Dosages: ~60 mg/kg
• Administration: 口服，每天一次

Sorafenib Tosylate是一种酪氨酸激酶(VEGFR和PDGFR)和RAF/MEK/ERK级联抑制剂，同时作用于Raf-1，wtBRAF和V599EBRAF，IC50分别为6 nM， 22 nM和38 nM。

靶点

体外研究

Sorafenib作用于这些细胞系(如 Mia PaCa 2, HCT 116, A549,和NCI-H460)，抑制ERK磷酸化,引起RAS/RAF通路的异常激活。Sorafenib作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞系，完全抑制 MAPK 通路的激活。 Sorafenib 抑制 MEK 1/2 和ERK 1/2 磷酸化，这种作用存在剂量依赖性，IC50分别为40 nM和 100 nM。Sorafenib 作用于MDA-MB-231细胞，对 PKB通路没有效果，说明Sorafenib 选择性抑制MAPK, 而不抑制PKB通路。Sorafenib 作用于人胰脏(Mia PaCa 2)和结肠 (HCT 116和 HT-29)肿瘤细胞系，抑制pERK。Sorafenib 抑制EGFR,IGFR-1,c-met,和 HER-2 RTKs ，IC50>10,000 nM。此外, Sorafenibis 有效抑制细胞中VEGFR-2信号。Sorafenib 抑制mVEGFR-2 (flk-1), mVEGFR-3, 和mPDGFR-β，IC50 分别为15 nM, 20 nM,和 57 nM。

体内研究

Sorafenib 按30 mg/kg或60 mg/kg 剂量每天口服处理HT-29肿瘤，与对照组相比，实验组50到80% MVA和 MVD受抑制。Sorafenib作用于Colo-205肿瘤, 可观察到MVA 和MVD明显受抑制，而不抑制MAPK。

生化实验:
测定抑制多种RAF激酶亚型的效果, Sorafenib加到反应buffer[20 mM Tris (pH 8.2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 和0.15% β-巯基乙醇] 中Raf-1(80 ng), wtBRAF, 或V599EBRAF (80 ng) 及MEK-1 (1 μg)的混合物中，DMSO终浓度为1%。加入25 μL 10 μM γ-[33P]ATP(400 Ci/mol)，开始 RAF 激酶实验(终体积为 50 μL)，在32 oC下温育25分钟。过滤到磷酸纤维素垫上收集磷酸化的MEK-1，使用 1% 磷酸冲洗未结合的放射性。微波加热烘干, 使用β-计数板测定过滤结合的放射性。

细胞实验：

• Cell lines: Colo-205, HT-29, 和DLD-1人结肠癌细胞
• Concentrations: 0 μM -10 μM
• Incubation Time: 2 小时
• Method: Colo-205, HT-29, 和 DLD-1人结肠癌细胞系按每孔 2 × 105个细胞接种在12孔组织培养板上，过夜，孔中含DMEM 生长培养基(10% 热灭活FCS)。使用无血清培养基冲洗细胞一次，然后在含0.1% 无脂肪酸BSA的DMEM培养基中 与溶于 0.1% DMSO的不同浓度Sorafenib温育120分钟，测定pMEK 1/2, pERK 1/2,或pPKB的改变量。使用冰冻 PBS (含0.1 mM钒酸盐的PBS ) 冲洗细胞，然后溶于含蛋白酶抑制剂的1% (v/v) Triton X-100溶液中。离心净化裂解物，然后进行SDS-PAGE,再转移到硝化棉膜上, 然后在 TBS-BSA中阻断,再使用anti-pMEK 1/2 (Ser217/Ser221; 1:1000), anti-MEK 1/2, anti-pERK 1/2 (Thr202/Tyr204; 1:1000), anti-ERK 1/2, anti-pPKB (Ser473; 1:1000), 或anti-PKB一抗做探针。使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行印迹，然后使用Amersham ECL试剂在Amersham Hyperfilm上进行显影。

动物实验：

• Animal Models: 携带HT-29和Colo-205细胞的雌性NCr-nu/nu小鼠
• Formulation: Cremophor EL/乙醇(50:50; 95%乙醇)
• Dosages: 30 mg/kg或60 mg/kg
• Administration: 口服处理

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.5698 mL

7.8489 mL

15.6978 mL

5 mM

0.3140 mL

1.5698 mL

3.1396 mL

10 mM

0.1570 mL

0.7849 mL

1.5698 mL

50 mM

0.0314 mL

0.1570 mL

0.3140 mL