Tofacitinib (CP-690550) Citrate是一种新型JAK抑制剂，对JAK3，JAK2，JAK1的IC50分别为1 nM, 20 nM 和112 nM。

靶点

体外研究

CP-690550抑制IL-2调节的人T细胞爆发式增殖，和IL-15诱导的CD69表达，IC50分别为11和48 nM。CP-690550抑制混合淋巴细胞反应，IC50为87 nM。CPCP-690550 处理含人野生型或V617F JAK2的鼠因子依赖的细胞Patersen–促红细胞生成素受体(FDCP-EpoR) 细胞，抑制细胞增殖，IC50分别为2.1 µM 和0.25 µM。CP-690550 抑制白细胞介素-6诱导的STAT1 和STAT3磷酸化，IC50分别为23和77 nM。而且, CP-690550作用于携带JAK2V617F的小鼠 FDCP-EpoR细胞，具有显著的促凋亡作用,然而效果比作用于携带野生型JAK2的细胞低。伴随着抑制关键JAK2V617F依赖的下游信号效应器信号转导的磷酸化，及(STAT)3, STAT5, 和v-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源(AKT)的转录激活。此外, CP-690550 在体外作用于人猕猴 NK 和CD8+ T 细胞，抑制IL-15诱导的CD69表达。

体内研究

CP-690550 作用于小鼠模型，降低迟发型超敏感反应和延长心脏移植存活。而且, CP-690550 处理来自JAK2V617F阳性 PV患者体内外膨胀的红系祖细胞，产生特定的抗增殖(IC50 = 0.2 µM) 和促凋亡活性。 相反, 在增殖(IC50 > 1.0 µM)和凋亡检测时，从健康对照组中的膨胀祖细胞对CP-690550敏感性低很多。 CP-690550按 10和30 mg/kg剂量每天处理NK细胞，持续处理2周，与对照组相比，细胞数显著降低,这种作用存在时间依赖性。 CP-690550处理实验组的动物效应小样记忆CD8+ 细胞数比对照组低55% 。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.9822 mL

9.9110 mL

19.8220 mL

5 mM

0.3964 mL

1.9822 mL

3.9644 mL

10 mM

0.1982 mL

0.9911 mL

1.9822 mL

50 mM

0.0396 mL

0.1982 mL

0.3964 mL

酶实验:
进行JAK1, JAK2, 和JAK3 激酶实验，使用在杆状病毒感染的 SF9细胞中表达的蛋白(GST 和人类JAK酶催化结构域的融合蛋白)，通过亲和层析在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶中纯化。反应底物是聚谷氨酸-酪氨酸 [PGT (4:1)], 按100 μg/mL包被到Nunc Maxi Sorp板上，在 37oC下过夜。然后冲洗板三次, 在每孔中加入JAK 酶，孔中含100 μL激酶buffer(50 mM HEPES, pH 7.3, 125 mM NaCl, 24 mM MgCl2) + ATP + 1 mM 钒酸钠)。按不同剂量加入CP-690550，进行激酶实验。然后在室温下温育30分钟，再冲洗实验板三次。通过标准ELISA实验，使用 磷酸化抗体测定一个给定孔中的磷酸化的酪氨酸水平。

细胞实验：

• Cell lines: HEL细胞, 扩增的红系祖细胞
• Concentrations: 0.1 μM,1 μM
• Incubation Time: 40分钟
• Method:

HEL细胞, 从正常供着，两个PV病人体内获得的扩大红系祖细胞，和 FDCP-EpoR受体细胞(每组样本2 × 107 个细胞),使用浓度不断增高的 CP-690550处理, 然后在不同时间点收集。细胞制成颗粒，使用冷磷酸盐缓冲液冲洗三次，然后悬浮在300 µL裂解液中 ，再在冰上处理1小时。细胞裂解液按20 000g转速在 4oC下离心20分钟,取出上清液。在上清液中加入15 µL anti-JAK2 (处理细胞) 或 anti-JAK3 兔抗体(未处理细胞)，然后在冰上再处理1小时。最后, 在上清液中加入50 µL 蛋白A/G琼脂糖浆，然后在 4oC下不断旋转温育过夜。冲洗抗体-蛋白复合体三次, 再使用放射免疫沉淀法(RIPA) buffer冲洗一次,使用冲洗冲洗一次,最后使用50 mM Tris-HCl buffer pH 为7.5冲洗一次。通过 Western blotting 分析免疫沉淀复合物，使用磷酸酪氨酸抗体，除去，再使用anti-JAK2和anti-JAK3抗体做探针，来分析免疫沉淀复合物。

动物实验：

• Animal Models: 毛里求斯成年猕猴
• Formulation: 在溶于蒸馏水的0.5%甲基纤维素中配制
• Dosages: 10, 30 mg/kg/d
• Administration: 口服饲喂

Tofacitinib是新型JAK3抑制剂，IC50为1 nM,作用于JAK2和JAK1选择性低20到100倍。

靶点

JAK3(Cell-free assay)

JAK1(Cell-free assay)

JAK2(Cell-free assay)

IC50

1 nM

112 nM

20 nM

体外研究

CP-690550 是特定的口服JAK3抑制剂, 作用于JAK2 和 JAK1,效果分别低20和100倍。CP-690550 对30种其他激酶没有作用效果，平均IC50 > 3000 nM。CP-690,550抑制IL-2诱导的增殖，比作用于GM-CSF诱导的增殖效果强30倍。CP-690550 高效抑制小鼠混合淋巴反应(MLR)(IC50 = 91 nM)。CP-690550 作用于小鼠B细胞，有效抑制 IL-4 诱导的 CD23 (IC50=57 nM) 和II 类主要组织相容性复合体(MHCII) 表达上调，IC50=71 nM。最新研究显示，通过加强 Th17分化，低剂量CP-690550加速实验性自身免疫脑脊髓炎的发生。

体内研究

CP-690550作用于异位心脏移植(DBA2供体心脏移到C57/BL6宿主 )的小鼠模型，提高移植后心脏的寿命，这种作用存在剂量依赖性。EC50(50%小鼠将保持移植 >28天时血液中药物浓度) 为~60 ng/mL。CP-690550 作用于非人灵长类动物 (NHPs, 食蟹猴) (50 到100 ng/ml剂量实验组和200 到400 ng/ml剂量实验组的MST分别为62和83天)，防止同种异体肾移植的排斥反应。CP-690550 每天按1.5-15 mg/kg剂量长期作用于小鼠，通过流式细胞仪检测，发现淋巴细胞亚群发生改变，这种作用存在剂量和时间依赖性。处理21天，观察到最显著的变化是脾NK1.1+TCRb 细胞数降低96%。CP-690550 按1.87-30 mg/kg剂量皮下注射给药敏感小鼠，延迟型过敏反应降低，这种作用存在剂量依赖性。

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

3.2013 mL

16.0067 mL

32.0133 mL

5 mM

0.6403 mL

3.2013 mL

6.4027 mL

10 mM

0.3201 mL

1.6007 mL

3.2013 mL

50 mM

0.0640 mL

0.3201 mL

0.6403 mL

JAK3 激酶实验:
全长cDNA中编码人JAK3 催化结构域(785aa到 1125aa, JH1 催化结构域)的片段通过PCR放大，且克隆到杆状病毒转移载体 pVL1393的EcoRI位点。使用重组杆状病毒感染 Sf9 细胞，在谷胱甘肽琼脂糖凝胶上分离重组 GSTJAK3融合蛋白。使用还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白，然后储存在含50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM DTT 和 10% 甘油的缓冲液中。通过ELISA按如下测量JAK3激酶活性: 使用随机L-谷氨酸和酪氨酸共聚物 (4:1) (100 ug/mL)包被实验板过夜。冲洗实验板，在有或无抑制剂时，重组JAK3 JH1:GST(每孔100 ng)在室温下温育30分钟，然后加入HRP结合的PY20抗磷酸酪氨酸抗体(ICN)，然后通过TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)电泳。使用 ELISA法测定酪氨酸激酶催化活性，而通过放射性酶实验测定丝/苏氨酸激酶。

细胞实验

• Cell lines: 人类T 细胞
• Concentrations: 0-4000 nM
• Incubation Time: 4天
• Method: 为了测量 IL-2依赖的增殖，分离的淋巴细胞按1-2 × 106/mL密度再悬浮在完全RPMI培养基(RPMI 1640含 10% (w/v)胎牛血清(FCS), 1%(w/v) 青霉素和链霉素 )中。加入植物血细胞凝集素(PHA)，终浓度为10mg/mL, 培养物在37oC 下含 5% (v/v) CO2 湿润孵育器中温育3天，用于上调IL-2R 和 JAK3 表达。在有或无CP-690,550 时，加入 IL-2 (200U/mL), 细胞在 37oC下含 5% (v/v) CO2湿润孵育器中温育，72小时后加入50 mL 3H-胸甘(5mCi/mL)。实验板再温育18小时，使用 96孔收集器收集，然后在闪烁计数器中计数。HUO3细胞培养在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养基中，人包皮成纤维细胞培养在含10% 胎牛血清的培养基中。在新鲜培养的细胞中加入CP-690550，培养4天。在培养期的最后18小时，加入3 H胸甘。

动物实验

• Animal Models: DBA/2 和 C57/BL6 小鼠
• Formulation: CP-690550 溶于PEG300
• Dosages: 0-136 ng/mL
• Administration: 渗透微泵输入