R788 (Fostamatinib) disodium是活性代谢产物R406的前体药物, 是Syk抑制剂，IC50为41 nM, 强抑制 Syk但不抑制Lyn,对Flt3作用效果低5倍。

靶点

Syk

IC50

41 nM

体外研究

R935788是R406亚甲基磷酸言药物前体,可在体内快速转化为R406。R406(R935788的活性形式)选择性抑制Syk依赖性信号，EC50为33 nM到171 nM,比作用于Syk非依赖性通路更有效。R406抑制多种弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系增殖，EC50为 0.8 μM到8.1 μM。R406 处理，降低BLNK, Akt, GSK-3, FOXO和ERK 磷酸化。此外, R406作用于TCL1白血病，完全抑制抗-IgM抗体诱导的BCR信号。尽管TCL1白血病中存在高水平的组成型激活的Syk，但是R406对白血病细胞没有选择毒性

体内研究

考虑到R406作用于小鼠的血浆半衰期短于 2小时，R935788分3次给药，每次间隔3小时，确保在每次给药期间Syk得到持续抑制，模仿作用于人类的较长血浆半衰期(15小时)。尽管在体外细胞毒性作用相对温和，但是R935788在体内显著抑制白血病细胞增殖和存活，这与阻止抗原依赖性B细胞受体（BCR）的信号相关，而与抑制组成型Syk活性无关。R935788每天按80 mg/kg剂量处理小鼠，持续 18-21 天，有效抑制 TCL1-002, TCL1-551 和 TCL1-870肿瘤生长，在处理末期观察不到白血病CD5+/B220+细胞，R935788显著延长处理鼠的寿命，平均寿命从 45/46天提高到170/172 天, 且在后期6个月的处理期间完全根除相当大比例的恶性细胞，且不会影响正常 B 淋巴细胞的产生。R935788治疗也诱导正常和恶性B细胞从脾脏和淋巴结中短暂迁移到外周血中，随后选择性抑制恶性B细胞生长。此外, R935788作用于Eμ-TCL1转基因小鼠，也有效作用于自发的TCL1白血病。

特征

R935788是临床上常用的药物前体 R406的口服试剂, 在药物性能上优于R406，具有较高的溶解度和生物利用度。

Fostamatinib (R788)

MB3912

R406

MB3962

R406 (free base)

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.6015 mL

8.0074 mL

16.0149 mL

5 mM

0.3203 mL

1.6015 mL

3.2030 mL

10 mM

–

–

–

50 mM

–

–

–

体外荧光偏振激酶检测实验:
R406在 DMSO中连续稀释，然后在激酶buffer(20 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 乙酰 BGG)中稀释到 1% DMSO。室温下，在激酶 buffer中加入ATP和底物，使DMSO 终浓度为0.2%。在含 5 μM HS1 肽底物和 4 μM ATP 的混合物中进行激酶反应，终体积为 20 μL，然后在激酶buffer中加入0.125 ng Syk 开始反应。反应在室温下进行40分钟。加入含EDTA/抗磷酸抗体/荧光磷酸示踪物（在FP 稀释 Buffer中稀释）的20 μL PTK淬灭混合物，反应终止。反应在室温下暗中反应30分钟，然后在Polarion 荧光偏振酶标仪上读数。通过与酪氨酸激酶实验试剂盒中的磷酸竞争剂竞争获得校准曲线，数据转换为磷酸数量。为了测定IC50，测定11种浓度R406，重复进行实验，使用 Prism GraphPad 软件，通过非线性回归分析进行曲线拟合。

细胞实验

• Cell lines: TCL1-002, TCL1-252, TCL1-551, TCL1-870, 和TCL1-540
• Concentrations: 溶于DMSO,终浓度为~10 μM
• Incubation Time: 48小时
• Method:

使用浓度不断增高的R406处理细胞 48小时。使用碘化丙啶(PI)和膜联蛋白-A5–FITC 联合双染色，测定凋亡细胞百分数。使用 FITC小鼠抗–Ki-67 抗体进行 Ki-67染色。通过FACSCalibur流式细胞仪，使用CellQuest Version 3.3 软件分析样本。

动物实验

• Animal Models: 腹腔注射 TCL1-002, TCL1-551, 或 TCL1-870 白血病细胞的雌性B6/C3H F1小鼠 , 和 Eμ-TCL1转基因小鼠
• Formulation: 在 0.1%羧甲基纤维素钠，0.1％甲酯，和0.02％丙酯 (pH 6.5)混合物中配制4 mg/mL溶液
• Dosages: 80 mg/kg/day
• Administration: 分3种剂量每个3小时腹腔注射