GSK126 是一种有效的，高选择性EZH2 methyltransferase抑制剂，IC50为9.9 nM，对 EZH2 的选择性比其他20种人甲基转移酶高1000多倍。

靶点

体外研究

在体外，EZH2野生型和突变型DLBCL细胞系中，GSK126最有效地抑制H3K27me3，其次是H3K27me2。GSK126也能有效抑制EZH2突变型DLBCL细胞系的增殖，并诱导敏感细胞系中EZH2靶基因的转录激活。在A687V EZH2突变细胞中，GSK126处理导致总体H3K27me3减少，强基因活化，胱天蛋白酶活化，以及增殖减少。在亲代H2087细胞中，GSK126抑制VEGF-A和磷酸化Ser(473)-AK的表达，因此引起对细胞增殖，迁移和代谢的抑制。

体内研究

在负荷KARPAS-422和Pfeiffer异种移植物的小鼠体内，GSK126 (150 mg/kg/d, i.p.)降低总体H3K27me3，增加基因表达，从而引起显著的肿瘤消退。

EPZ6438

1 mg

5 mg

10 mg

1 mM

1.8987 mL

9.4936 mL

18.9872 mL

5 mM

0.3797 mL

1.8987 mL

3.7974 mL

10 mM

–

–

–

50 mM

–

–

–

EZH2 试验:
制备包含野生型或突变型EZH2的5个组分的PRC2复合物(Flag–EZH2，EED，SUZ12，AEBP2，RbAp48)。GSK126在DMSO中溶解，以0.6 nM到300 nM的浓度测试，终DMSO浓度为2.5%。体外实验中，相对于更倾向H3K27me0作为底物的野生型EZH2，EZH2 Y641倾向于H3K27me2作为底物，而对H3K27me0 或H3K27me1的活性很低。A677G不同于EZH2的野生型和Y641突变型，它有效地使H3K27me0，H3K27me1，和H3K27me2甲基化；因此，组蛋白H3多肽(残基21–44；终浓度10 μM)与 K27me0 (野生型，A677G EZH2)，K27me1 (A677G EZH2)，或K27me2 (A677G，Y641N，Y641C，Y641H，Y641S 和 Y641F EZH2)用作甲基转移酶底物。GSK126加入到板中，然后加入6 nM EZH2复合物和多肽。GSK126的效能处于或接近[SAM] = Km下进行的试验的紧密结合界限，IC50值在竞争性底物SMA相对其Km(7.5 μM SAM，而 SAM Km为0.3 μM)较高浓度下测量。在这些条件下，酶浓度的作用相对非常小，可以计算出Ki的精确估计值。反应通过[3H]-SAM起始，培养30分钟，加入500倍过量未标记的SAM淬灭反应，甲基化产物肽在磷酸纤维素过滤器上根据供应商提供的MSPH 多屏幕平板进行捕获。表观Ki值使用竞争性抑制剂的Cheng–Prusoff关系计算。IC50=Ki (1+[S]/Km)+[E]/2，其中E是酶，S为底物。

细胞实验

• Cell lines: 46 淋巴瘤细胞系
• Concentrations: 0~10 μM
• Incubation Time: 6天
• Method:

所有细胞系的最优细胞接种根据经验确定，通过检测在384孔板式中宽范围的接种密度以确定可以增殖6天的试验条件。然后细胞以最佳接种密度接种24小时，再用20点两倍连续稀释的GSK126 或0.15% DMSO处理(一式两份)。板在37℃下在5% CO2中培养6天。然后将细胞用CellTiter-Glo (CTG)裂解，化学发光信号用TECAN Safire2酶标仪检测。此外，未处理板中的细胞在化合物加入(T0)时进行采集以定量初始细胞数。处理6天后得到的CTG值表示为T0值的百分比，并以化合物浓度为横坐标绘图。数据拟合为4参数方程以产生浓度反应曲线，并测定抑制50%生长(生长 IC50)的GSK126浓度。

动物实验

• Animal Models: 负荷 Pfeiffer 或 KARPAS-422 肿瘤的雌性米黄色 SCID 小鼠
• Formulation: 20% captisol
• Dosages: 150 mg/kg/day
• Administration: i.p.